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          正文
        原代細胞的培養方法
        文章來源:上海滬峰化工有限公司   添加時間:2020/10/22 11:46:22 點擊率:647

        原代細胞的培養也叫初代培養,是從供體取得組織細胞在體外進行的培養,是建立細胞系的第一步,是一項基本技術。原代細胞因剛從組織中分離開,生物學特性未發生很大變化,仍保留原來的遺傳特性,也最接近和反映體內生長特性,適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。   

        原代細胞往往有多種細胞組成,比較混雜,即使從形態上為同一類型(上皮樣或成纖維樣),但細胞間仍有很大差異。如果供體不同,即使組織類型、部位相同,個體差異也照樣存在,原代細胞生物特性尚不穩定,如需做較為嚴格的對比性實驗研究,還需進行短期傳代培養。   

        1、組織塊培養法   

        組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法,也是早期采用培養細胞的方法,故原先被稱為組織培養。其方法:為將剪成的小組織團塊接種于培養瓶(或皿)中,瓶壁可預先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細胞能沿瓶壁向外生長,方法簡便,利于培養,部分種類的組織細胞在小塊貼壁24小時后細胞就從組織塊四周游出,然后逐漸延伸,長成肉眼可以觀察到的生長暈,5~7天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發生漂浮,此漂浮小塊可隨換液而棄去,由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片,可在顯微鏡下觀察形態和用于實驗研究。  

        其培養方法如下:   

        (1)按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm3大小的小塊,并加入少許培養基使組織濕潤。   

        (2)將小塊均勻涂布于瓶壁,每小塊間距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培養瓶(底面積為17.5cm2)可接種20~30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉培養瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內。   

        (3)培養2~4小時,待小塊貼附后,將培養瓶緩慢翻轉平放,靜置培養,動作要輕,嚴禁搖動和來回振蕩,以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養失敗,若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養時培養基不宜多,以保持組織塊濕潤即可,培養24小時后再補液,培養初期移動和觀察時要輕拿輕放,開始幾天盡量不去搬動,以利貼壁和生長,培養3~5天時可換液,一方面補充營養,一方面去除代謝產物和漂浮小塊所產生的毒性作用。   

        原代細胞培養-2   

        2.消化培養法   

        該方法是采用前述的消化分散法,將妨礙細胞生長的細胞間質(包括基質、纖維等)去除,使細胞分散形成細胞懸液,然后分瓶培養。   

        某些特殊類型細胞,如內皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟,將在有關章節中敘述。   

        3.懸浮細胞培養法   

        對于懸浮生長的細胞,如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化,可采用低速離心分離,直接培養,或經淋巴細胞分層液分離后接種培養。   

        4.器官培養   

        器官培養是指從供體取得器官或組織塊后,不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養,其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和、并能存活,器官培養的目的和技術均與單層細胞培養不同,但可利用器官培養對器官組織的生長變化進行體外觀察。并觀察不同培養條件研究對器官組織的影響。器官培養可保持器官組織的相對完整性,可用于重點觀察細胞間的、排列情況和相互影響,以及局部環境的生物調節作用。

        1. 器官培養的特殊的要求   

        (1)需要特殊的培養條件 因器官離體培養,其營養和氧氣僅靠自然滲透來供給,因此,培養時為了確保中心不發生缺乏氧和營養而造成壞死,其厚度或直徑不宜超過1mm。   

        (2)器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法:   

        a. 將器官組織塊置于培養基氣液面以利于氣體交換。   

        b. 提高培養基中的氧分壓,一般需加注純氧,提高氧分壓時仍需保持5% CO2,以維持pH。   

        2. 器官培養的方法   

        (1)將不銹鋼網做成的支架,放置于培養皿中,高度為1/2皿高,使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   

        (2)將培養基加入平皿中,使培養液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起。   

        (3)將要培養的器官組織平放在濾膜上,一般厚度不要超過200μm,水平面積不超過10mm2,如為肝、腎不能大于1mm2。   

        (4)將培養物置于CO2培養箱內,并加注氧氣,調整氧分壓達90%,培養時注意使液面與膜保持在一致的水平上。   

        (5)上述器官培養1~3周(每隔2~3天換液一次)后可用于實驗和檢測。


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